Le sol constitue une source extraordinairement riche en bactéries de toutes sortes. Ces micro-organismes jouent un rôle essentiel dans la décomposition de la matière organique végétale et animale, la fixation des éléments inorganiques et les interactions avec les racines des plantes et les particules du sol. Même dans un échantillon minuscule, comme celui contenu dans une simple cuillère à soupe de terre, on trouve des millions de bactéries individuelles.
Le défi consiste donc à diluer suffisamment l'échantillon de sol pour que la concentration bactérienne devienne assez faible pour séparer une bactérie unique des autres, lui permettant ainsi de se développer en une colonie pure sur une gélose nutritive. Cette technique, appelée isolement bactérien, est fondamentale en microbiologie.
Matériel nécessaire
- Bouillon trypticase soja
- Tubes à essai de 5 ml, stérilisés et bouchés
- Bâtonnets de glace en bois stériles
- Crayon marqueur à cire
- Portoir à tubes
- Essuie-tout en papier
- Eau de Javel (solution à 10 %)
- Brûleur Bunsen
- Allumettes
- Anse d'inoculation
- Gélose trypticase soja
- Boîtes de Petri
- Étuve d'incubation
- Réfrigérateur
Étape 1 : Prélever l'échantillon de sol
Réservez un tube à essai stérile et bouché contenant 5 ml de bouillon nutritif trypticase soja. Choisissez un bâtonnet de glace en bois stérile.
Rendez-vous à l'extérieur et prélevez un petit échantillon de sol avec le bout du bâtonnet, en respectant une technique stérile. Cette méthode garantit que l'échantillon ne soit pas contaminé et que vous ne risquiez aucune infection.
Ouvrez le tube à essai et ajoutez-y le sol prélevé dans le bouillon nutritif. Mélangez la terre au bouillon à l'aide du bâtonnet, puis rebouchez le tube. Inscrivez la date et le lieu de collecte sur la paroi du tube avec le crayon à cire.
Placez le tube dans un portoir pendant environ 30 minutes afin de laisser le temps au sol de se déposer au fond.
Étape 2 : Ensemencer la boîte de Petri
Désinfectez votre plan de travail en le nettoyant avec la solution d'eau de Javel à 10 % et des essuie-tout en papier.
Retournez la boîte de Petri de manière à ce que le fond contenant la gélose soit orienté vers le haut. Tracez un « T » sur le fond : la barre horizontale doit séparer le tiers supérieur, tandis que la tige verticale divise les deux tiers inférieurs en deux moitiés égales.
Allumez le brûleur Bunsen et passez l'anse d'inoculation dans la flamme jusqu'à ce qu'elle devienne rouge incandescent.
Ouvrez le tube à essai et touchez délicatement la couche supérieure du liquide le plus clair avec l'anse. Retirez-la puis rebouchez immédiatement le tube.
Étape 3 : Réaliser le striage en T
Utilisez la barre horizontale du « T » tracée au dos du fond comme repère. Posez l'anse d'inoculation d'un côté de la zone située au-dessus de la barre, puis dessinez un trait en zigzag à la surface de la gélose jusqu'au côté opposé.
Sortez l'anse et refermez la boîte. Passez-la de nouveau dans la flamme du Bunsen et laissez-la refroidir brièvement. Rouvrez la boîte, touchez un point proche de l'extrémité de la première ligne tracée, puis réalisez un nouveau zigzag perpendiculaire à la première ligne, couvrant le premier espace sous la barre du T et un côté de la tige.
Retirez l'anse et refermez la boîte. Flamber à nouveau l'anse, rouvrez la boîte, puis touchez la deuxième ligne près de son extrémité avec l'anse légèrement refroidie. Tracez un troisième zigzag perpendiculaire à la deuxième ligne dans l'espace restant libre de la boîte.
Refermez la boîte de Petri après avoir retiré l'anse. Flambez celle-ci et mettez-la de côté. Éteignez le brûleur Bunsen.
Étape 4 : Effectuer la culture secondaire
Placez la boîte de Petri dans une étuve à 30 °C pendant 48 heures. Sortez-la ensuite et examinez la gélose à la recherche de colonies bactériennes. Sélectionnez une colonie dont l'apparence générale est homogène et bien délimitée — signe qu'elle provient d'une seule bactérie. Entourez son emplacement au dos du fond avec le crayon marqueur.
Flambez l'anse d'inoculation. Ouvrez la boîte de Petri et touchez le centre de la colonie sélectionnée avec l'anse légèrement refroidie.
Répétez les étapes du striage en T sur une nouvelle boîte de Petri contenant de la gélose. Une fois le striage effectué et la boîte refermée, inscrivez la date et l'origine de l'échantillon de sol au dos du fond. Éteignez le brûleur Bunsen.
Incuvez cette nouvelle boîte à 30 °C pendant 48 heures. Examinez les colonies apparues sur la gélose en vérifiant l'uniformité de leur couleur, de leur forme et de leur texture. Si certaines colonies diffèrent nettement des autres, cela indique qu'une seule bactérie n'a pas été isolée : recommencez alors la procédure de culture secondaire.
Réfrigérez la boîte de gélose présentant des colonies d'aspect identique. Cette uniformité constitue un bon indicateur qu'une seule souche bactérienne a été isolée de l'échantillon de sol.
Si vous le souhaitez, poursuivez avec d'autres tests d'identification de la bactérie isolée : coloration de Gram, examen microscopique ou culture sur différents types de géloses sélectives.
Source : https://jardin.98905.com/garden-lawn/soil/1007006478.html